Semiconservadora
En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicación del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicación es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicación:
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- Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales.
- Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original.
Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento (división celular, que requiere la replicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó mediante una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.
La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existían aún cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.
El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.
Secuencial y bidireccional desde puntos fijos
Los orígenes de replicación son los puntos fijos que estan a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.
El origen de replicación
Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).
Secuencialidad
Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular, además de ser fácilmente transformables. El método consistía en transformar cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de los codones que los codifican en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias transformantes en un "medio mínimo" (para que sólo pudieran crecer éstas), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción, aparecía con mayor frecuencia el gen de uno de los aminoácidos (el correspondiente a la "posición 1"), con una menor frecuencia el gen del aminoácido adyacente al primero ("posición 2"), el adyacente al segundo ("posición 3") aparecía con menor frecuencia que el segundo y así sucesivamente hasta el gen que ocupaba la última posición. El experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de transformación, que la replicación sigue un orden (es secuencial).
La replicación avanza en forma de horquilla
Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas), que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.
Bidireccionalidad
El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario). Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación.
No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.
La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se añade timidina marcada y luego sin marcar, y siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN. También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).
Semidiscontinua
La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.
Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tuneko Okazaki (o Tsuneko Okazaki) en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.
